Zobrazit další navigaci
Celý web BIOTRIN
22.V.2006

TEXT REFERÁTU NA SEMINÁŘI ČZU 18. 5. 2006

Jaroslav Drobník

Šlechtitelské metody byly až do vstupu genového inženýrství podobné střílení do černého terče v tunelu. Vše bylo otázkou náhody. Genetický základ organismů se přirozeně mění mutacemi, náhodnými změnami, ze kterých člověk užitečné vybíral a vhodně je kombinoval. Nástroje šlechtitelů byly po staletí jednoduché: výběr a křížení. Výběr může být pozitivní – pro množení se použijí nejvýhodnější jedinci, nebo negativní – nevhodní jedinci se vyřadí. Tak nenajdeme dnes např. bílou mrkev, protože člověk dával přednost té červené.

Teprve v polovině 18. století vyřešil otázku pohlaví u rostlin C. Linné. Velkým pokrokem bylo objevení zákonitostí křížení Gregorem Mendelem, které vešly ve všeobecnou známost až počátkem 20. století. Do té doby šlechtitelé při křížení postupovali spíše podle "citu" a tradice, ale výsledky byly dosti náhodné. Ale i s využitím Mendelových zákonů klasické šlechtitelství narazilo na svou hranici: vlivem vazby genů se při křížení spolu se žádoucím genem dostávají do potomstva i geny nežádoucí. Významnou pomoc přineslo používání hybridních osiv. Ta využívala tzv. heterosního efektu, což znamená, že kříženec v první generaci je silnější a dává lepší výnos než jeho rodičovské odrůdy.

Obtížné bylo šlechtění klonově množených rostlin jako je např. brambor nebo chmel. Stále zde byl hlavní problém, že šlechtitel musel ve všech případech čekat na náhodné změny – mutace – způsobené chybou při přenosu dědičné informace. Moderní šlechtitel se naučil poškozováním aparátu zajišťujícího dědičnost zvyšovat počet a rychlost výskytu mutací, ale zacílit je, tj. zařídit, aby se změnila určitá vlastnost a směrem, který si přál, to stále neuměl.

Umělé narušení se využívalo k mutačnímu šlechtění. K vyvolávání mutací lze použít vlivů poškozujících DNA, která se reparačními mechanismy sice opraví (jinak by organismus nepřežil), ale vzniknou chyby. Často se používá záření nebo chemikálie. Náš známý šlechtitel docent Josef Bouma vzal zrna ječmene odrůdy Valtický a u přítele ho ozářil zubařským rentgenem. Z těchto semen vyšlechtil slavnou odrůdu Diamant. Měla o 200 až 300 klasů víc na čtvereční metr, stéblo bylo o 15 cm kratší, takže nepoléhalo a výnos o 12% vyšší než původní odrůda. Dnes se např. na velkých plochách pěstuje radiační mutant - halotolerantní rýže, připravená v rámci programu Mezinárodní agentury pro atomovou energii. Jiným radiačním mutantem jsou růžové bezjaderné greapfruty.

Mutační šlechtění je ovšem založeno na vzniku řady mutovaných genů a mutovaných – nepůvodních – bílkovin. Nevíme kolik nových mutovaných genů vzniklo a jak se liší mutované bílkoviny od původních, takže nemůžeme posoudit ani význam nových genů pro ekologii ani zdravotní dopad nových mutovaných bílkovin. Touto neprůhledností je mutační šlechtění nejrizikovější metodou získání nových odrůd.

Jinou biotechnologickou metodou je navození dědičných změn v rostlinných tkáňových kulturách. Pomocí rostlinných hormonů se připraví z některé části rostliny nediferencované pletivo – kalus, ve kterém narušením přenosu dědičného aparátu vzniká aneuploidie (změna v počtu chromosomů) a další dědičné změny. Pří růstu kalusu samy odpadnou mutace, které vedou k neživotaschopným buňkám, zůstanou jen ty životaschopné, takže výsledná rostlina, která z kalusu vznikne, může být užitečný mutant. Takovému vzniku mutantů se říká somaklonální variabilita.

K narušování přenosu chromosomů se běžně používá jed ocúnu - kolchicin – a generují se tak polyploidní odrůdy. Jiná metoda používá protoplasty, tj. buňky zbavené stěny, které lze spojovat a to i protoplasty buněk rostlin, které by se nikdy nekřížily. Po splynutí dvou protoplastů se navodí regenerace buněčné stěny, vznik kalusu a pak celé rostliny. Je amfidiplooidní, tj. počet chromosomů je součtem diploidních počtů chromosomů obou komponent. Tak mohou vznikat mazirodoví i mezičeleďoví kříženci.

Významnou metodou je somatická embryogenese a zejména gametická embryogenese, tj. vypěstování rostlinného embrya z pylu - androgenese. Takové embryo je ovšem haploidní a polyploidizací lze získat dihaploidní rostlinu, tj. s dvojitou sadou chromosomů, které jsou však identické, takže taková rostlina odpovídá ideální čisté linii.
Až když věda dospěla k poznání zápisu dědičných vlastností v nukleových kyselinách (zejména DNA), objevila enzymy schopné DNA na určitém místě “rozstřihnout“ tak, aby vznikly konce, které se snadno spojí a znovu „sešijí jinými enzymy“, když prostudovala malé, do kružnice spojené molekuly DNA nazvané plasmidy - pak teprve šlechtitel mohl nastoupit cestu k cílené změně zvolené vlastnosti.

Poznáme-li, jak vlastně všechno začalo, budeme dnešní dění vidět v jiném světle. Na začátku byla- jako u mnoha objevů – vědecká zvědavost. Dva kalifornští vědci byli zvědaví, co se stane, když metodou plasmidů vnesou gen žáby do běžné bakterie. Zkusili to v roce 1973 – a bakterie produkovala žabí bílkovinu. Zrodila se technika rekombinantní DNA (rDNA), neboli „stříhání genů“, čili genové inženýrství. Vzhledem k tomu, že umožňuje přenášet geny nazývá se transgenose a zákonodárci ji nazvali genetická modifikace, výsledný organismus pak geneticky modifikovaný –GMO.

Prvně byl přenos genů prakticky využit k přípravě lidského inzulínu, který se liší od běžně používaného prasečího, což některým diabetikům vadí. Vědci kalifornské firmy Genentech připravili gen pro inzulín - řetězec 153 nukleotidů připravili - chemickou syntézou a dva mladí vědci Dennis Kleid a Dave Goeddel v upraveném skladišti ho vnesli do bakterie. Získali oba řetězce hormonu a spojili je v noci z 23. na 24. srpna 1978. Těch asi 20 nanogramů inzulínu způsobilo, že za dva roky, 14. října 1980 nastal historický den pro Genentech a transgenosi vůbec. Burza na Wall Street po otevření dala do prodeje 1,1 milionu akcií Genentech po 35 USD. Za 20 minut jejich cena byla 89 a večer uzavírala na 711/4. Boyer a Swanson, kteří zakládali firmu Genentech částkou 500 USD každý, nyní získali po 66 milionech USD. To byl start boomu biotechnologického průmyslu.

S velkým přísunem peněz rostly biotechnologické firmy jako houby po dešti. Některé upadly, jiné prosperují dodnes. Hlavním produktem byly peptidy pro farmaceutický průmysl připravované fermentaci z geneticky modifikovaných bakterií nebo kvasinek. Měly pro zdravotnictví ohromný význam: podstatně snížily cenu léků pro pacienty a zvýšily jejich bezpečnost. Dříve se totiž vyráběly z lidského materiálu (mrtvol, dárců) a byly nešťastné případy, kdy se s nimi přenesly choroby (např. AIDS). Díky tomu veřejnost přijímala přenos genů velice pozitivně.

Po roce 1985 se začala transgenose pronikat do šlechtění rostlin. To nebyla náhlá revoluce, ale postupné organický výsledek zavádění moderních biotechnologických metod. Přenášení genů začala sama v příroda. Názorným příkladem je vznik pšenice. Mutací před asi deseti tisíci lety – patrně v jihovýchodních kopcích dnešního Turecka - vznikla jednozrnná pšenice. Pak se zkřížila s "kozí trávou", a když se v kříženci zmnožil počet chromosomů – vznikl tetraploid - , zvýšila se úroda tehdejších zemědělců pšenicí dvouzrnkou. Někde, patrně u Kaspického moře, se zkřížila s další trávou (mnohoštětem) a tak se narodil předek dnešní pšenice.

Dnes provádí přenos genů šlechtitel, aby získal odrůdu s určitou požadovanou vlastností. Především je důležité, aby šlo o vlastnost řízenou nejlépe jedním nebo několika málo geny a někde v přírodě takový gen najít. Může se hledat v jakémkoli organismu, protože kód, kterým je gen zapsán v molekule DNA, je universální pro vše živé. Molekulární genetika má metody, jak z DNA vystřihnout právě ten úsek, který představuje zvolený gen. Současně se z bakterie získá kružnicová DNA plasmidu, „rozstřihne“ se stejnými enzymy, jakými se získal úsek DNA představující gen, a ten se do kružnice vloží. Takto „nastavený“ plasmid se zavede zpět do bakterie. Bakterie lze snadno mnohonásobně namnožit, čímž se namnoží i plasmid a v něm vložený gen. Tomu se říká „klonování genů“.

Stejným způsobem se namnožené geny vnesou do plasmidu půdní bakterie rodu Agrobacterium, která v přírodě dovede své plasmidy a geny v nich obsažené vnášet do rostlin. Tato schopnost byla objevena již v roce 1977, ale teprve metody rekombinantní DNA s využitím „stříhání genů“ umožnily využít tohoto „trojského koně“ ke vnášení požadovaných genů do rostlinné buňky. Z ní se musí vypěstovat celá rostlina s novým genem řídícím požadovanou vlastnost.

Tam, kde bakterie-vektor selhává, plasmid s genem se vpravuje do rostlinné buňky „násilím“ – nastřeluje se sorbován na malé kuličky těžkého kovu – obvykle zlata nebo se DNA vpravuje do buněk mikroinjekcí. Jsou i případy – takovým je oblíbená pokusná rostlina molekulárních botaniků – huseníček (Arabidopsis), kterému k získání nového genu stačí namočit semena do suspense bakterií Agrobacterium.

Rostliny se liší v schopnosti přijmout cizí geny. Jednou z nejsnáze modifikovaných rostlin je tabák a proto na něm se provedla celá řada výzkumů. Příbuzným tabáku je rajče a to je důvod, proč první prakticky zavedenou geneticky modifikovanou plodinou bylo právě rajče. Kupodivu, žádná nová vlastnost se mu nepřidala, naopak genetickou modifikací se utlumil enzym štěpící pektin. To zabránilo měknutí rajčat, takže pro obchod se nemusela trhat nezralá, aby vydržela transport, ale dozrálá s vyvinutou chutí a vůní. Proto jejich komerční název byl Flavr-savr , což je anglická hříčka, protože se čte fleivr-sejvr a to znamená zachovávající si vůni.

Je vidět, že metoda transgenose není vůbec jednoduchá, ale je to metoda nejen přímočará k získání požadované vlastnosti, ale i transparentní, protože poskytuje neúplnější informace, co se s rostlinou vlastně stalo a tak umožňuje důkladnou kontrolu všech důsledků. Tím se jí žádná jiná šlechtitelská metoda nevyrovná.

Má ovšem nevýhodu, že je proti ostatním metodám velmi nákladná. To má několik důsledků: takovou investici s nejistým koncem (odrůda se v praxi nemusí osvědčit) si mohou dovolit jen velké společnosti nebo vlády, a z ekonomických důvodů (aby se investované prostředky vrátily) ji patentují. Proto se vývoj prvních GMP zaměřil na takové, které mají zřetelné výhody pro zemědělce a tím je zajištěn jejich odbyt. Podcenilo se, že také zemědělec potřebuje mít jistý odbyt svých produktů, o čemž rozhoduje spotřebitel.

Rozvoj biotechnologických metod pokračoval. Významným urychlením šlechtění je šlechtění na genetické markery. Analýzou DNA lze zjistit, která zvláštnost v její struktuře – marker – je spojena s požadovanou vlastností – např. chutí broskve. Pak lze už u klíčících semen zjistit, zda kříženec tuto vlastnost zdědil a není třeba čekat, až vyroste strom a začne plodit.

I transgenose se rychle vyvíjí a odstraňuje některé „dětské nemoci“. K nalezení transformovaných buněk se na počátku používalo paralelního vnesení genů dovolující buňkám růst i v přítomnosti antibiotik, která netransformované buňky zahubila. To vyvolávalo obavy z přenosy těchto genů na bakterie, a proto se takové geny už nepoužívají, případně máme metody, jak pomocné geny z výsledné odrůdy odstranit. Nadějné je také vnášení genů nikoli do jaderného, ale do plastidového genetického aparátu. Jednak je ho v rostlinné buňce větší množství (chloroplastů je mnoho, jádro zpravidla jedno) a takový gen se nepřenáší pylem.

Zbývá ještě mnoho otázek k vyřešení. Především zatím neumíme rozhodnout, do kterého místa dědičného zápisu v DNA – genové mapy – transgen zařadíme. Vzniká tzv. inzerční mutagenese, která má podobně jako chemická či radiační mutagenese náhodný charakter. Její podstatou je vliv, který má vložení transgenu na okolní geny. V důsledku toho může mít výsledná odrůda i jiné změny v dědičnosti než jen vložený znak. Proto je nezbytná důkladná kontrola vlastností získaných GMO.

Pokroky molekulární biologie a analytických metod přinesly přečtení genomu mnoha organismů, mezi nimi i rostlin. Známe pořadí „písmen“ genetického zápisu třeba u huseníčku, ale také u rýže a dalších plodin. Dokonalé využití této znalosti při transgenosi teprve čeká na rozvoj.

I historie genového inženýrství se pohybuje ve spirále. Uvedli jsme, že velký úspěch měla příprava farmaceuticky cenných peptidů v bakteriích a kvasinkách. Ukazuje se, že jejich produkce v rostlinách by byla ještě levnější a bezpečnější. Nejen to. Geneticky modifikované rostliny mohou poskytovat suroviny i pro jiný chemický průmysl – třeba pro biodegradovatelné plasty a maziva a rozšiřovat uplatnění nepotravinářského zemědělství, které zejména v Evropě má velký politicko-ekonomický význam.

Samostatnou kapitolou je význam transgenních plodin pro rozvojové země, ale to se již vymyká z tohoto přehledu.

Jaroslav Drobník
Přírodovědecká fakulta UK
Sdružení BIOTRIN

Reminder to content type on to